Odczynniki

Z mojej praktyki, wygodniejsze i pewniejsze jest stosowanie roztworu wodnego niż kryształków. Aplikuje się krople odczynnika na powierzchnię trzonu (u gołąbków), dobrze jest zadrapać badane miejsce co przyśpiesza przenikanie odczynnika (powierzchna trzonu gołąbków jest dość hydrofobowa). U koźlarzy aplikuje się odczynnik na miąższ na przekroju owocnika.

U większości gołąbków występuje w kilka do kilkunastu sekund mniej lub bardziej intensywne morelowo-pomarańczowe zabarwienie. Rzadko brak reakcji, to wyróżnia np. gołąbek zielonawofioletowy (Russula cyanoxantha) od innych podobnych, np. gołąbek fiołkowozielony (Russula ionochlora) o szybkiej i silnej morelowej reakcji miąższu. Nieliczne gołąbki, np. z kręgu Russula xerompalina mają zieloną reakcję miąższu. Odczynnik jest też stosowany na miąższu koźlarz (Leccinum), gdzie nie występuje rakcja lub o zielono-brązowawa o różnej intensywności.

W reakcji z tymi kwasami następuje żółte, zielone lub brązowe przebarwienie. Kwas azotowy wraz z aniliną jest wykorzystywany w tzw. rakcji Schaeffera u pieczarka (Agaricus). Stężony kwas siarkowy oraz rozcieńczony HCl są też wykorzystywane przy mikroskopowaniu.

Kwas siarkowy jest używany dla barwnych reakcji makrochemicznych w rodzaju koralówka (Ramaria).

Odczynnik musi być chroniony przed światłem, dostępem powietrza i jest trujący.

Cenny np. u koźlarz (Leccinum). U części gatunków daje szybko (kilka, kilkanaście sekund) inetnsywną czerwoną barwę miąższu. Wyróżnia np. gatunki z kręgu koźlarz babka (Leccinum scabrum) brakiem takiej reakcji. U gołąbków daje powolną (kilka, kilkanaście minut), różową barwę miąższu.

Zobacz uwagi przy alfa-naftolu który można stosować jako zamiennik gwajaku i jest łatwiejszy w użyciu (choć nie daje tak pięknych barw jak gwajak).

Ponieważ naftol może być łatwiejszy do pozyskania niż żywica gwajaku można go stosować jako zamiennik. Naftol jest też łatwiejszy w przygotowaniu roztworu (rozpuszcza się w alkoholu łatwo i niemal natychmiast) i chyba roztwór jest trwalszy.

Oczynniki stosowane w mikroskopii

Nawilżanie suchego materiału

Wg. Breitenbacha /Breitenbach J., Kraenzlin F., 1986 [26II]/ woda niekoniecznie jest najlepszym zwilżaczem ponieważ dezorganizuje materiał. Poleca on bardziej wyrafinowany sposób wg receptury Clemencon:
Do zwilżania służy roztwór: 80ml 96% etanolu (spirytus rektyfikowany), 20ml stężonego amoniaku, 1ml gliceryny.
Materiał jest zwilżany kilkoma kroplami tego roztworu, po kilku minut jest nawilżony, jeśli jest zbyt wilgotny, pozwala mu się nieco podeschnąć, aby nabrał woskowej konsystencji, wtedy można wykonać potrzebne przekroje do preparatu.
Sam preparat umieszcza się w amoniaku lub innych, opisanych poniżej odczynnikach aby się rozprostował i rozluźnił.

Jeśli używamy do obserwacji świeżego materiału, co jest zwykle wygodniejsze, oczywiście umieszczamy preparat w odpowiednim medium.

Kwas siarkowy jest używany dla barwnych reakcji makrochemicznych w rodzaju koralówka (Ramaria).

Zobacz uwagi przy alfa-naftolu który można stosować jako zamiennik gwajaku i jest łatwiejszy w użyciu (choć nie daje tak pięknych barw jak gwajak).

Ponieważ naftol może być łatwiejszy do pozyskania niż żywica gwajaku można go stosować jako zamiennik. Naftol jest też łatwiejszy w przygotowaniu roztworu (rozpuszcza się w alkoholu łatwo i niemal natychmiast) i chyba roztwór jest trwalszy.

Oczynniki stosowane w mikroskopii

Nawilżanie suchego materiału

Wg. Breitenbacha /Breitenbach J., Kraenzlin F., 1986 [26II]/ woda niekoniecznie jest najlepszym zwilżaczem ponieważ dezorganizuje materiał. Poleca on bardziej wyrafinowany sposób wg receptury Clemencon:
Do zwilżania służy roztwór: 80ml 96% etanolu (spirytus rektyfikowany), 20ml stężonego amoniaku, 1ml gliceryny.
Materiał jest zwilżany kilkoma kroplami tego roztworu, po kilku minut jest nawilżony, jeśli jest zbyt wilgotny, pozwala mu się nieco podeschnąć, aby nabrał woskowej konsystencji, wtedy można wykonać potrzebne przekroje do preparatu.
Sam preparat umieszcza się w amoniaku lub innych, opisanych poniżej odczynnikach aby się rozprostował i rozluźnił.

Kongo Red to barwnik stosowany w analityce chemicznej jako wskaźnik pH oraz w medycynie jako barwnik wybarwiający utwory amyloidalne.
Barwnik ma postać proszku. Przygotowanie roztworu polega na rozpuszczeniu w proporcji 0.1 g Kongo Red w 10ml stężonego roztworu amoniaku (25%) (rzadziej stosuje się też roztwór wodny). Roztwór wymaga przefiltrowania po dobie dla uzyskania klarowności. Roztwór powinien mieć intensywną barwę czerwonego atramentu. Wymaga sporządzenia na nowo po ulotnieniu się amoniaku - przechowywać w możliwie szczelnych pojemnikach.

Najczęściej używa się w formie błękitu mlekowego. Receptura sporządzenia: rozpuścić 0.05 g barwnika w 30 g kwasu mlekowego, po 24h przefiltrować. Zobacz też laktofenol.
Używany też czasem w formie roztworu wodnego w proporcji 1:1000. Do dobrego wybarwienia w temperaturze pokojowej potrzeba godzin lub kilku dni. Dla szybkiego uzyskania efektu preparat podgrzewa się na płomieniem (do zagotowania).

Zarodniki lub komórki silniej wybarwiające się błękitem anilinowym (w kwasie mlekowym) są określane jako cjanofilne.

Sporządza się go jako roztwór 0.1 g błękitu anilinowego w mieszaninie: 20 g kryształów fenolu, 20 g kwasu mlekowego, 40ml gliceryny (Baral podaje 20ml) , 20ml wody. Ten roztwór umożliwia wykonywanie stosunkowo trwałych preparatów.

Służy do określenia metachromatyczności komórek. Barwnik ten barwi wszystki tkanki, jednak niektóre elementy przyjmują odmienną, czerwono-fioletową barwę, są wtedy nazywane metachromatycznymi.

Ważne jest to, że jest to tzw. barwnik przyżyciowy. W wersji roztworu wodnego nie zabija komórek. Analogiczne barwi błękit toluidynowy (ang. toluidyn blue).
Rodzaj zabarwienia zależy głównie od odczynu pH. W środowisku zasadowym jest niebieski (szaroniebieski, turkusowo-niebieski), w środowisku kwaśnym jest fioletowy, czerwonawo-fioletowy. Różnicuje barwnie krople tłuszczu (ang. lipid body, LB) - zabarwiają się słabo, blado-różowo od ciałek wakuolarnych (ang. vacuolar body, refractive body, VB) które barwią się intensywnie turkusowo-niebiesko. Wakuole barwią się zwykle jednorodnie fioletowo-niebiesko. Mogą się też w nich tworzyć pod wpływem barwnika, drobne, kuliste, ciemnoniebieskie ciałka metachromatyczne (MB). Zjawiska te można zasadniczo oglądać jedynie w żywych komórkach. Gdzie barwnik ten jest akumulowany w wakuolach. Martwa cytoplazma wybarwia się jednolicie. Warstwa żelowa barwi się fioletowo. Bezbarwne żywiczne wydzieliny przyjmują zabarwienie turkusowo-niebiesko. /Baral H.O., 2001 [103]/.

Wodny roztwór barwnika jest krótkotrwały. Przygotowuje się go jako nasycony roztwór. W praktyce wystarcza szczypta na 10ml wody destylowanej. Po dobie filtrować. Trwałość wg mojego doświadczenia przynajmniej kilka miesięcy.

Wg. Clemencon można też sporządzić stosunkowo trwały roztwór alkoholowy: 0.2-0.5 g błękitu krezolowego, rozpuszczony w mieszaninie: 17ml glicerolu, 27 mm 97% alkoholu etylowego (spirytus rektyfikowany) i 55 mm wody destylowanej, 0.5ml Invadin IFC (co to jest?). Po tygodniu przefiltrować.

Koncentrat przygotowuje się rozpuszczając 2 g w 100 ml 70% etanolu. Do barwienia przygotowuje się mniej trwały roztwór w proporcji 30 ml koncentratu, 100 ml wody destylowanej i 1 ml 1% roztworu KOH. Może wymagać przed użyciem przefiltrowania.

Roztwór w proporcji 1:1 przygotwany z kryształków waniliny i 70% kwasu siarkowego (3 ml wody, 8 ml stężonego kwasu siarkowego).

Ponieważ roztwór jest wybitnie nietrwały (nie może być zczerniały) zwykle przygotowuje się go bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym z kropli stężonego kwasu siarkowego, kropli wody i kilku kryształków waniliny. Jeśli przechowujemy musi też być chroniony przed światłem.

Analogiczne efekty uzyskamy zastępując wanilinę formaliną (sulfoformol).

Charakterystyczne mikroskopowe reakcje barwne

amyloidalny

Zmieniający barwę w odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor szaroniebieski do ciemnoniebieskiego, aż czarnego np. urzeźbienie zarodników gołąbek (Russula) (umożliwiając obserwację tego urzeźbienia - inaczej niewidocznego), pozwala też różnicować gatunki w obrębie rodzaju na posiadające amyloidalne zarodniki i z nieamyloidalnymi zarodnikami (np. u muchomor (Amanita)). Możemy też pamiętać ze szkoły średniej tą barwną reakcję obserwowaną na ziarnach skrobi ziemniaczanej. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz też dekstrynoidalny.

cjanofilny

Silnie wybarwiający się w błękicie anilinowym. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni wybarwiają się intensywniej niż inne tkanki - nazywamy je cjanofilnymi.

dekstrynoidalny

Zmieniający barwę w odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor brązowy, czerwonawy do winno-czerwonego. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz też amyloidalny.

metachromatyczny

Elementy tkanek i komórek odmiennie, czerwono-fioletowo, wybarwione przy barwieniu błękitem krezolowym.

reakcja Schaeffera

Stosuje się u pieczarka (Agaricus). Rysuje się na powierzchni kapelusza kreskę wodą anilinową i na krzyż drugą kreskę stężonym kwasem azotowym. W przypadku pozytywnej reakcji miejsce przecięcia przybiera płomieniście pomarańczową barwę. Reakcja negatywna to brak zmiany zabarwienia powierzchni kapelusza.

Wodny roztwór barwnika jest krótkotrwały. Przygotowuje się go jako nasycony roztwór. W praktyce wystarcza szczypta na 10ml wody destylowanej. Po dobie filtrować. Trwałość wg mojego doświadczenia przynajmniej kilka miesięcy.

Wg. Clemencon można też sporządzić stosunkowo trwały roztwór alkoholowy: 0.2-0.5 g błękitu krezolowego, rozpuszczony w mieszaninie: 17ml glicerolu, 27 mm 97% alkoholu etylowego (spirytus rektyfikowany) i 55 mm wody destylowanej, 0.5ml Invadin IFC (co to jest?). Po tygodniu przefiltrować.

Roztwór w proporcji 1:1 przygotwany z kryształków waniliny i 70% kwasu siarkowego (3 ml wody, 8 ml stężonego kwasu siarkowego).

Analogiczne efekty uzyskamy zastępując wanilinę formaliną (sulfoformol).

Charakterystyczne mikroskopowe reakcje barwne

amyloidalny

Zmieniający barwę w odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor szaroniebieski do ciemnoniebieskiego, aż czarnego np. urzeźbienie zarodników gołąbek (Russula) (umożliwiając obserwację tego urzeźbienia - inaczej niewidocznego), pozwala też różnicować gatunki w obrębie rodzaju na posiadające amyloidalne zarodniki i z nieamyloidalnymi zarodnikami (np. u muchomor (Amanita)). Możemy też pamiętać ze szkoły średniej tą barwną reakcję obserwowaną na ziarnach skrobi ziemniaczanej. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz też dekstrynoidalny.

cjanofilny

Silnie wybarwiający się w błękicie anilinowym. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni wybarwiają się intensywniej niż inne tkanki - nazywamy je cjanofilnymi.

dekstrynoidalny

Zmieniający barwę w odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor brązowy, czerwonawy do winno-czerwonego. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz też amyloidalny.

metachromatyczny

Elementy tkanek i komórek odmiennie, czerwono-fioletowo, wybarwione przy barwieniu błękitem krezolowym.

reakcja Schaeffera

Stosuje się u pieczarka (Agaricus). Rysuje się na powierzchni kapelusza kreskę wodą anilinową i na krzyż drugą kreskę stężonym kwasem azotowym. W przypadku pozytywnej reakcji miejsce przecięcia przybiera płomieniście pomarańczową barwę. Reakcja negatywna to brak zmiany zabarwienia powierzchni kapelusza.