Odczynniki stosuje się dla wywołania dodatkowych cech co ułatwia lub czasami wręcz umożliwia określenie gatunku grzybów.
Odczynniki w mikroskopii stosuje się analogicznie - tj. dla charakterystycznego wybarwiania komórek lub ich elementów oraz dodatkowo dla stworzenia optymalnego kontrastu przy obserwacji mikroskopowej. Często dzięki barwnikom uwidacznia się normalnie niewidoczne struktury mikroskopowe.
Niezbędnik
Skompletowanie wszystkich odczynników może być dość trudne. Są jednak te absolutnie niezbędne (bo często stosowane i dających odróżniające reakcje dla licznych gatunków grzybów o dużych owocnikach) i stosunkowo łatwe do pozyskania.
Postaraj się mieć zawsze pod ręką do wywoływania reakcji makrochemicznych:
1.
2. Wodny roztwór
Świetnie, gdy będziesz jeszcze miał
Szczegółowy opis przygotowania odczynników, reakcji i ich stosowania znajduje się poniżej.
Odczynniki do reakcji makrochemicznych
- KOH lub NaOH, wodorotlenek potasu lub wodorotlenek sodu
-
Oba wodorotlenki powinny dawać identyczną reakcję i mogą być zamiennie stosowane. Jeśli jest możliwość należy jednak preferować KOH jako częściej cytowane w literaturze. Stosuje się stężony roztwór wodny, w granicach 30 – 50%. Singer zaleca stosowanie mniej stężonego 25% dla rodzaju zasłonak (Cortinarius). Wodorotlenki te są sprzedawane w postaci białych, stałych, płatków. Przygotowanie polega na rozpuszczeniu wodorotlenku w wodzie destylowanej. Rozpuszczać należy wsypując płatki małymi partiami i mieszając - Uwaga! substancja żrąca, koniecznie nałożyć okulary dla ochrony oczu. Należy uważać ponieważ podczas rozpuszczania szybko rośnie temperatura roztworu. Roztwór wodny można przechowywać nieograniczenie długo, światło nie szkodzi. Lepsze są pojemniki plastikowe z polietylenu, ponieważ odczynnik rozpuszcza szkło (butelki nie przeżre na wylot, ale w ten sposób odczynnik jest zanieczyszczany. W razie kontaktu ze skórą należy możliwie szybko spłukać dużą ilością wody.
Badanie wykonuje się kładąc kroplę odczynnika na badaną część grzyba. Zwykle jest to powierzchnia trzonu, powierzchnia kapelusza lub miąższ w różnych częściach owocnika. Zwykle nie występuje zmiana zabarwienia lub jedynie słabe brunatnienie lub żółknięcie. W przypadku niektórych gatunków ten odczynnik powoduje intensywną reakcję barwną np. muchomor jadowity (Amanita virosa) na wszystkich częściach owocnika przybiera w kilka sekund intensywnie cytrynowożółtą do chromowżółtej barwę. W ten sposób można odróżnić zewnętrznie niemal identycznego mleczaj piekący (Lactarius bertillonii) od mleczaj chrząstka (Lactarius vellereus), sok mleczny tego pierwszego pod działaniem odczynnika natychmiast przyjmuje pomarańczową barwę. Wśród zasłonak (Cortinarius) odczynnik stosowany na skórkę kapelusza, różne miejsce trzonu i miąższ w przypadku niektórych gatunków daje silną barwną reakcję. Podobnie w przypadku niektórych wodnicha (Hygrophorus).
W niższym stężeniu (2 – 5%) roztwory tych wodorotlenków są wykrzystywane przy mikroskopowaniu, dla rozmiękczenia i ułatwienia rozdzielenia komórek materiału.

Ten odczynnik wyróżnia podgrzybek grubosiatkowany (Xerocomus ferrugineus) spośród innych podgrzybków barwną zielononiebieską reakcją skórki kapelusza na swoje opary.
Kwas siarkowy jest używany dla barwnych reakcji makrochemicznych w rodzaju koralówka (Ramaria).
Zobacz uwagi przy
Ponieważ naftol może być łatwiejszy do pozyskania niż żywica gwajaku można go stosować jako zamiennik. Naftol jest też łatwiejszy w przygotowaniu roztworu (rozpuszcza się w alkoholu łatwo i niemal natychmiast) i chyba roztwór jest trwalszy.
Oczynniki stosowane w mikroskopii
Nawilżanie suchego materiału
Suchy materiał (eksykaty) jeśli jest bardzo kruchy wymaga nawilżenia aby można było wykonać cięcie lub rozdzielić fragmenty bez obawy pokruszenia całego okazu. Można "uelastycznić" eksykat przez zamknięcie go na jakiś czas w małym plastikowym pojemniku do którego wkładamy kawałek nawilżonego papieru - tak jednak aby nie dotykał nawilżanego materiału. Po odcięciu milimetrowego fragmentu do obserwacji (dla preparatów gniecionych, np. u workowców 1 mm2 jest często wystarczający) umieszczamy go w wodzie lub w roztworze zasady (5 – 10%
Wg. Breitenbacha /Breitenbach J., Kraenzlin F., 1986 [26II]/ woda niekoniecznie jest najlepszym zwilżaczem ponieważ dezorganizuje materiał. Poleca on bardziej wyrafinowany sposób wg receptury Clemencon:
Do zwilżania służy roztwór: 80ml 96% etanolu (spirytus rektyfikowany), 20ml stężonego
Materiał jest zwilżany kilkoma kroplami tego roztworu, po kilku minut jest nawilżony, jeśli jest zbyt wilgotny, pozwala mu się nieco podeschnąć, aby nabrał woskowej konsystencji, wtedy można wykonać potrzebne przekroje do preparatu.
Sam preparat umieszcza się w
Barwienie preparatów
W razie konieczności zastosowania kilku barwników (a tak jest zazwyczaj) obserwacje wykonuje się w kolejności: wDla ułatwienia zwilżenia materiału można stosować dodatek detergentu. Częstym problemem jest wysychanie medium w czasie obserwacji mikroskopowej - pomocne jest dodanie ok. 10%
KOH może wywoływać barwne reakcje, podobnie jak amoniak. Zawartość niektórych cystyd wybarwia się na żółto (są to wtedy tzw. chrysocystydy).
Odczynnik Melzera - 0.5 g jodu, 1.5 g jodku potasu w 20 cm3 wody. Przed badaniem dodaje się równą ilościowo ilość wodzianu chloralu. Odczynnik ma trwałość do kilku miesięcy. Kłopot może wynikać z uwagi na to, że wodzian chloralu jest substancją trującą nie znajdującą się w normalnym obrocie handlowym. Na szczęście możemy z powodzeniem zastąpić ten odczynnik dostępnym w aptece:
płynem Lugola - roztwór 1 częsci jodu i 2 części jodku potasu w 150 (do 300) częściach wody.
Praktycznie różnicy w wybarwieniu nie ma (w Melzerze teoretycznie tkanki powinny być przejrzystsze). Przy pomiarach dla celów naukowych warto jednak pozyskać Melzera z racji na to, że może występować różnica w stopniu pęcznienia tkanek pomiędzy oboma odczynnikami.
Wodny roztwór barwnika jest krótkotrwały. Przygotowuje się go jako nasycony roztwór. W praktyce wystarcza szczypta na 10ml wody destylowanej. Po dobie filtrować. Trwałość wg mojego doświadczenia przynajmniej kilka miesięcy.
Wg. Clemencon można też sporządzić stosunkowo trwały roztwór alkoholowy: 0.2 – 0.5 g błękitu krezolowego, rozpuszczony w mieszaninie: 17ml glicerolu, 27 mm 97% alkoholu etylowego (spirytus rektyfikowany) i 55 mm wody destylowanej, 0.5ml Invadin IFC (co to jest?). Po tygodniu przefiltrować.
Roztwór w proporcji 1:1 przygotwany z kryształków waniliny i 70% kwasu siarkowego (3 ml wody, 8 ml stężonego kwasu siarkowego).
Analogiczne efekty uzyskamy zastępując wanilinę formaliną (sulfoformol).
Charakterystyczne mikroskopowe reakcje barwne
- amyloidalny
- Zmieniający barwę w
odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor szaroniebieski do ciemnoniebieskiego, aż czarnego np. urzeźbienie zarodników gołąbek (Russula) (umożliwiając obserwację tego urzeźbienia - inaczej niewidocznego), pozwala też różnicować gatunki w obrębie rodzaju na posiadające amyloidalne zarodniki i z nieamyloidalnymi zarodnikami (np. u muchomor (Amanita)). Możemy też pamiętać ze szkoły średniej tą barwną reakcję obserwowaną na ziarnach skrobi ziemniaczanej. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz teżdekstrynoidalny . - cjanofilny
- Silnie wybarwiający się w
błękicie anilinowym . Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni wybarwiają się intensywniej niż inne tkanki - nazywamy je cjanofilnymi. - dekstrynoidalny
- Zmieniający barwę w
odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor brązowy, czerwonawy do winno-czerwonego. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz teżamyloidalny . - metachromatyczny
- Elementy tkanek i komórek odmiennie, czerwono-fioletowo, wybarwione przy barwieniu
błękitem krezolowym . - reakcja Schaeffera
- Stosuje się u pieczarka (Agaricus). Rysuje się na powierzchni kapelusza kreskę
wodą anilinową i na krzyż drugą kreskę stężonym kwasem azotowym. W przypadku pozytywnej reakcji miejsce przecięcia przybiera płomieniście pomarańczową barwę. Reakcja negatywna to brak zmiany zabarwienia powierzchni kapelusza.