TLC - procedura krok po kroku

1. ekstrakcja
2. przygotowanie szablonu z opisem próbek
3. przygotowanie komory chromatograficznej
4. naniesienie analitu na płytkę TLC
5. (opcjonalnie) rejestracja fotograficzna próbek w świetle białym, UV krótko- i długofalowym
6. wysuszenie płytek - swobodnie, na powietrzu, z dobrą wentylacją, ok. 30 minut;
7. kondycjonowanie płytki
8. rozwijanie chromatogramu
9. zaznaczenie frontu eluentu
10. suszenie wstępne płytki
11. obserwacja suchej płytki, fotografia:
    1. w świetle białym odbitym
    2. białym przechodzącym
    3. UV krótkofalowym (UV254)
    4. (opcjonalnie) UV długofalowym (UV-A)
12. suszenie dokładne płytki z eluentu
13. spryskanie wodą zdemineralizowaną
14. obserwacja mokrej
15. suszenie płytki z wody
16. spryskanie kwasem
17. wygrzewanie płytki
18. obserwacja w długofalowym (UV-A)
19. obserwacja w świetle białym odbitym i przechodzącym
20. po kilku dniach obserwacja w świetle białym odbitym i przechodzącym
21. opracowanie i analiza zebranych danych

Ekstrakcji substancji porostowych wg [207.4] dokonuje się przez namoczenie fragmentów plechy w ok. 1 ml acetonu przez 5 minut w zamkniętej probówce 1.5ml Epfendorfera położonej na ciepłej płytce (aceton wrze w temperaturze 56°C); otworzenie probówki i zatężenie rozpuszczalnika przez odparowanie części roztworu (do max. 1/10 pierwotnej objętości).

W praktyce próbki przygotowuję znacznie (dni) wcześniej. Długi czas pozwala na wyługowanie substancji w temperaturze pokojowej. W zależności od ilości plechy należy zalać ją taką ilością acetonu aby była przykryta z lekką nawiązką. Jeśli acetonu jest dużo w stosunku do plechy, przed nanoszeniem na płytkę warto zatężyć próbkę przez pozostawienie probówki przez jakiś czas otwartej.

Spis próbek w arkuszu kalkulacyjnym, w formie tabeli do wydruku która będzie jednocześnie szablonem i dokumentacją płytki.

Ponadto należy przygotować analogiczny szablon w formie prostej linijki z zaznaczeniem pozycji próbek w zadanym rozstawie, na zadanej szerokości płytki, która po wycięciu będzie służyła za wygodny szablon przy nakładaniu próbek.

Patrz niżej fotografie nakładania próbek i rejestracji fotograficznej chromatogramów.

Komora powinna być wysycona parami eluentu. Eluent nalewa się na dno komory tak aby tworzył warstwę nie wyższą niż 5 mm. Czas wysycania to około godzina.

W przypadku dużej komory / dużych płytek pomocne jest też wyłożenie ścianek (przynajmniej od strony sorbentu płytki) bibułą filtracyjną dobrze nasyconą eluentem, "przykleja" on bibułę do ścianek wystarczająco skutecznie. Należy zostawić "okienko" na podgląd na obserwację postępu frontu eluentu. W przypadku wyklejenia tylko jednej ścianki można obserwować postęp frontu z drugiej strony komory, prześwietlając latarką komorę od przeciwnej strony, tj. od strony bibuły/sorbentu.

Próbki nanosi się jako plamki, w jednej linii, na wysokości ok. 15-20 mm od dolnej krawędzi płytki. Muszą być powyżej poziomu eluentu w komorze. Linię próbek delikatnie rysujemy ołówkiem przy linijce.

Odległość pomiędzy punktami nanoszenia to przynajmniej 8 mm. Zalecana to 10 mm. Próbki blisko brzegu będą znacznie różniły się realizowanym współczynnikiem Rf w stosunku do kolejnych, z uwagi na "efekt brzegowy". Zaleca się rozpoczynać od 2 cm od brzegu. W praktyce można wykorzystać skrajne tory dla mniej istotnych próbek.

Przykładamy szablon i nanosimy plamki analitu na płytkę przy pomocy kapilary lub użytej w tej funkcji jednorazowej końcówki pipety 200µl;. Należy dążyć do uzyskania plamki o możliwe możliwie małej średnicy, ok. 4-5 mm. Uzyskuje się to przez chwilowe dotknięcie (bez przytrzymania) kapilary do powierzchni płytki. Po wyschnięciu plamki, co trwa kilka do kilkunastu sekund, w tym samym miejscu ponownie przytykamy kapilarę itd. aż do jej opróżnienia, co wymaga kilku przyłożeń.

Nanosi się analit zawarty w jednym nabraniu kapilary lub kilku, do uzyskania odpowiedniej ilości analitu na płytce. Zwykle potrzebne jest jednokrotne, rzadziej kilkukrotnie nabranie roztworu do kapilary.

Przy zbyt małej ilości analitu chromatogram może być mało czytelny, barwy niecharakterystyczne lub trudne do określenia.

Zbyt duża ilość analitu, przekraczająca zdolność sorbcyjną żelu ("przedobrzenie"), jest bardziej szkodliwa. Tworzą się "ogony" a rozwinięte plamy szeroko rozlewają, zachodząc na sąsiednie paski.

Określenie ile to jest odpowiednia ilość, jest kwestią wyczucia, które przychodzi z praktyką. Można kierować się ciemnością plamki w UV254. Jeśli jest "dość ciemna", to zwykle oznacza właściwą (lub zbyt dużą) ilość analitu.

Jeśli jest blada, to może oznaczać różne rzeczy: a) zbyt małą ilość analitu lub b) często jednak oznacza właściwą ilość analitu ale o niskiej zawartością substancji pochłaniających UV, lub c) brak u danego gatunku substancji porostowych.

Na szablonie z opisem należy odnotować większą niż jeden ilość "zadanych kapilar roztworu". Po wywołaniu chromatogramu i jego analizie pozwala to na decyzję które próbki warto powtórzyć i o ile skorygować ilość analitu na płytce.

Aceton szybko schnie, należy jednak odczekać ok. 30 minut przed rozwijaniem na doskonałe wysuszenie płytek, swobodnie, na powietrzu, z dobrą wentylacją.

W tym czasie (opcjonalnie) można wykonać dokumentację próbek w świetle białym, UV krótko- i długofalowym. Sens tej dokumentacji w przypadku UV254 jest taki, że pozwala w przypadku powtarzania chromatogramu określić właściwszą ilość analitu. W przypadku UV-A widać charakterystyczną dla danego gatunku fluorescencję wyciągu substancji porostowych, teoretycznie zgodną z tą jaką ma plecha; w przypadku światła białego widać pigmentację plechy.

Kondycjonowanie płytki TLC ("preequilibrate") wykonuje się przez wysycenie parami (dla eluentu C) kwasu octowego przez 10 minut. Płytka jest umieszczona w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku, na dnie którego jest rozlany kwas octowy. Płytka jest umieszczona nad nim na podstawkach, tak by nie zamoczyć.

Płytkę wyjmuje się z kondycjonowania i spokojnie umieszcza się w komorze chromatograficznej (patrz przygotowanie komory) próbkami w dół, tak aby nie dotykała bokiem do ścianki naczynia, w pozycji sorbentem ku ściance z przyklejoną bibułą (jeśli taka jest), możliwie pionowo lub w pozycji z sorbentem w dole bliżej w górze dalej od ścianki komory.

Komora w czasie rozwijania powinna być ustawiona poziomo. W spokojnym miejscu. Nie podlegająca wstrząsom.

Rozwijanie chromatogramu w eluencie C - dla drogi 16 cm to około 1 h, dla mniejszych długości nieproporcjonalnie krócej (tempo postępu frontu eluentu maleje z odległością).

Niezwłocznie po wyjęciu płytki z komory chromatograficznej trzeba ołówkiem zaznaczyć dokąd doszedł front eluentu.

Do fotografii można przejść po wstępnym osuszeniu płytki (nie jest ona "optycznie mokra"). Przed spryskaniem wodą lub kwasem płytka musi być bardzo dobrze wysuszona z eluentu (patrz "obserwacja mokrej płytki).

Obserwacja w świetle dziennym odbitym i przechodzącym (widoczne plamy secalonic acid i pochodnych).

Obserwacja w UV krótkofalowym (UV-C) - uwidocznienie substancji pochłaniających UV jako ciemnych plam (substancje aromatyczne), rzadziej świecących przy tym oświetleniu (np. jasnoniebiesko świecące: kwas alektoronowy i α-collatiolic acid).

W literaturze nie spotkałem danych tego rodzaju ale warto też wykonać fotografię w świetle UV długofalowym, bo niesie ona jakąś informację różnicującą. Występująca fluorescencja jest zwykle podobna ale mniej liczna, niż w tym oświetleniu po wywołaniu w kwasie.

Przed spryskaniem płytki wodą (zdemineralizowaną), a jeśli pomijamy ten etap, to przed wywołaniem w kwasie, płytka musi być dobrze wysuszona z eluentu. W przypadku mało lotnych rozpuszczalników (a do takich należy kwas octowy) należy wspomóc się suszarką do włosów. Stopień wysuszenia kontrolować można węchem - powinien pozostać co najwyżej nieznaczny zapach octu.

Mokra płytka umożliwia obserwację tłustych substancji ("fatty acids"), niewidocznych w innych sposobach oświetlenia. Płytkę ułożoną na czarnym tle obserwuje się / fotografuje się oświetloną z góry.

wywołanie chromatogramu - po krótkim wysuszeniu, zwilżenie 10% H2SO4, rozpylaczem, tak aby nie ściekało, ogrzanie w 110°C przez 10 minu; uwidaczniają się różne plamy barwy zależnej od substancji;

Obserwacja w UV długofalowym (UV-A) - fluorescencja różnobarwna; wykonywać bezpośrednio po ostudzeniu płytki, stosując filtr odcinający większość światła widzialnego; inaczej trudno dostrzeć i/lub zinterpretować barwę fluorescencji.

Obserwacja w świetle białym - bez zbędnej zwłoki, po ostudzeniu płytki (z czasem blakną); dodatkowe purpurowe i niebieskie plamy odpowiadają triterpenom i steroidom (sterydom);
często silnie wybarwione plamy mają otoczkę (halo) innej barwy, słabsze plamy mają barwę odpowiadającą halo silnych plam.
Zdecydowanie polecam wykonanie fotografi w świetle przechodzącym - jaskrawość plam jest zdecydowanie wyższa, lepiej też widać słabe plamy.

Niektóre plamy nie blakną lecz w pierwszych dniach stają się wyraźniejsze, zmieniają barwę, dlatego można powtórzyć obserwację w świetle białym.

Najciekawszy ale i najtrudniejszy etap pracy.

W przypadku fotografii, obrabiając je, warto maksymalnie podnieść kontrast i skorygować balans bieli.

Odniesienie współczynnika Rf należy traktować jako względne, względem znanych substancji. Przy 20 próbkach na płytce zwykle w części są pospolite, łatwe do identyfikacji substancje porostowe lub można takie kontrolne próbki celowo wprowadzić na płytkę. Często używane, charakterystyczne substancje kontrolne to np.: atranoryna, kwas usninowy, kwas salacynowy. Zwłaszcza plamki o wysokim Rf będą znacznie obiegać (zwykle in minus) od wzorcowych wartości z literatury. Nie ma ścisłej powtarzalności pomiędzy kolejnymi wykonaniami chromatogramu tej samej próbki, ponieważ na realizowany Rf wpływa zbyt dużo, nie podlegających kontroli czynników, np. atmosferycznych, starzenie się eluentu, stopień aktywacji sorbentu.

Dla identyfikacji należy więc kierować się względnym Rf w stosunku do próbek kontrolnych oraz barwą plamy w różnych trybach obserwacji. Przy bardziej złożonych przypadkach należy wykonać chromatogram w innych eluentach, dających odmienny rozdział substancji na pasku.