TLC - chromatografia cienkowarstwowa

Wykonywanie TLC w warunkach domowych jest możliwe. W zasadzie nawet "w szklance na parapecie". Trudność techniczna jest nieduża. Stosowane odczynniki dostępne i (przy odpowiednim obejściu) niezbyt groźne. Koszt wykonania jednej próbki można zbić poniżej 2zł (nie licząc jednorazowej inwestycji w sprzęt).

Problemem kosztowym jest wstępna inwestycja (ceny podaję z 2020 roku). W oprzyrządowaniu i odczynnikach to, w zależności od wariantu, od kilkuset do 2-3 tysięcy złotych. Plus, sporym wydatkiem, którego trudno uniknąć, są gotowe płytki do TLC - standardowo wykorzystywane w lichenologii są sprzedawane w pakietach 25/50/100 sztuk kosztujących od ok. 500 do ponad tysiąca złotych. Pakiet wystarcza (w zależności od formatu płytki i upakowania na niej próbek) na wykonanie 400-1200 próbek.

Teoretycznie można samemu przygotować płytki TLC co może zmniejszyć ich koszt o ponad połowę (żel z indykatorem F254 kupując markowy u Merck'a). Mam wątpliwości jednak, czy taka babranina ma sens, poza możliwością wyprodukowania wtedy płytek dowolnego rozmiaru np. na mikroskopowym szkiełku przedmiotowym. Nie praktykowałem (może kiedyś to zrobię).

Akcesoria ochronne - fartuch, rękawice, okulary ochronne UV. Kilkadziesiąt złotych. Nie używa się szczególnie szkodliwych substancji, tym niemniej są one przynajmniej drażniące, czasem żrące, dlatego operacje z odczynnikami należy wykonywać pod wyciągiem, a przynajmniej w strumieniu przewiewu z otwartego okna. Spryskiwanie kwasem siarkowym poza domem. Szczegółowo o tym w procedurze wykonania.

Menzurka i/lub jednorazowe pipety plastikowe Pasteur'a (lub szklane) dla odmierzenia odczynników (w zakresie 1-kilkadziesiąt ml) oraz szklane butelki 100-250ml do przechowywania eluentu (z plastikową nakrętką) i wywoływacza (może być ze szklanym korkiem szlifowanym). Plastikowe butelki do eluentu się nie nadają - rozpuszczalniki powoli "przełażą" przez ścianki co można wyczuć zapachem. Wydatek ok. 100zł.

Rozpuszczalniki do sporządzenia eluentu. Najczęściej stosowany i wygodny eluent C - to mieszanina toluenu i lodowatego kwasu octowego (w proporcji objętościowej 170:30). Mieszanina jest trwała. Zużywa się kilka do kilkunastu ml na płytkę (zależy od wielkości płytki, komory i czy robi się sekwencję płytek). Koszt zakupu 1 litrowych lub mniejszych opakowań rozpuszczalników, co wystarcza na grube kilkadziesiąt lub więcej płytek (zależy m.in. od tego czy wykonuje się sekwencje płytek, czy pojedynczo), to ok. 100zł.

10% roztwór kwasu siarkowego (H₂SO₄) do wywoływania rozwiniętego chromatogramu. To roztwór nadal silnie żrący i drażniący. W praktyce należy rozcieńczyć stężony kwas siarkowy w proporcji 1 kwasu : 9 wody. Okulary! Rękawice. Zawsze wlewamy stopniowo kwas do wody - inaczej roztwór wrze i pryska z potencjalnie tragicznymi konsekwencjami!

Aceton - dla ekstrakcji substancji porostowych z plechy. 1l to kilkadziesiąt złotych.

Jednorazowe zamykane probówki Epfendorfera 1-2ml dla ekstrakcji i przechowywania ekstraktu. Plastikowe podstawki pod probówki. Koszt 1000 szt. probówek i kilku podstawek to ok. 100zł.

Opcjonalnie ciepła płyta lub innego rodzaju podgrzewacz o temp. ok. 50°C dla przyśpieszenia ekstrakcji i odparowania acetonu. Wykonałem taką ze sklejonych żywicą chemoutwardzalną kilku szkiełek przedmiotowych z zatopionym w żywicy drutem oporowym tak dobranej długości aby zasilany z zasilacza mikroskopowego PZO (napięcie regulowane, max. 6V) uzyskiwał temperaturę ok. 50°C.
W praktyce jak próbka kilka dni postoi w temperaturze pokojowej w acetonie zamknięta w probówce, to też się wyługuje co trzeba.

Jednorazowe końcówki pipet automatycznych 200 µm (żółte) do podawania próbki na płytkę TLC. Pipeta nie jest potrzebna; końcówki służą za kapilarę. 1000 szt. to kilkadziesiąt złotych.

Płytki TLC z żelem krzemionkowym 60 i indykatorem F254. Standardem są płytki Merck'a. Do kupienia przez ich stronę internetową. W praktyce lichenologicznej sens mają jedynie szklane (plastik odpada z uwagi na wygrzewanie, aluminiowe szybko rozłażą się po kwaśnym wywołaniu - jeśli nie zależy nam na archiwizacji i jesteśmy w stanie szybko wykonać obserwację/fotografię oraz zrezygnujemy z obserwacji w świetle przechodzącym, to ujdą). Wadą szklanych jest trudność przycinania; w praktyce trzeba je wykorzystywać w całości; zaletą trwałość w archiwizacji i możliwość łatwego wykonania wszelkich zalecanych obserwacji.

W grę wchodzą formaty 10 × 20 cm lub 5 × 10 cm np. o numerach katalogowych 105802, 105804, 105729. Przy rozwijaniu wzdłuż boku 10 cm, na jednej płytce na odcinku 20 cm można upchać 22 (+2 próbki skrajne) (co 8mm) lub 17+2 (co 1cm), na 5 cm odpowiednio 3+2 lub 4 próbki. Przy krawędzi płytki są silne "efekty brzegowe" - substancje w górnym odcinku pasków idą szybciej w górę im bliżej krawędzi, stąd jedna lub dwie skrajne próbki są trudniejsze do interpretacji.

Pierwszy pakiet płytek kupiłem w wersji 20 × 20 ze strefą zatężania 2.5 cm. Okazało się, to zbędne i niekorzystne cenowo. Problemem jest duży rozmiar plamki podawanej na strefie zatężania, wymusza to odległość próbek przynajmniej 10 mm od siebie, a i to przy większej ilości analitu "paski mogą zachodzić na siebie". Zalecana przez [207.4] długa, 17 cm droga rozwijania, okazała się kłopotliwa w realizacji, mimo zastosowania się do wszelkich szykan technologii. W efekcie wykorzystuję ten pakiet dwustronnie, zadając próbki tylko poza strefą zatężania, tak jakby była to płytka 20 × 17.5 cm; a że próbki są z dwóch stron, to rozwijane są na drodze ok. 7 cm.

Otwarte płytki zalecają przechowywać w szczelnym pojemniku nad żelem suszącym z indykatorem wysycenia wodą. Tak czynię stosując do tego duży, szczelnie! zamykany plastikowy pojemnik spożywczy. Praktycy mówią, że można sobie ten sposób przechowywania podarować.

Drugi analogiczny szczelny pojemnik do kondycjonowania płytki w parach eluentu przed wywołaniem.

Komora do chromatografii z pokrywą. Przy małych płytkach może to być podana na początku szklanka, przykryta szalką Petriego. Dla rozwijanych na boku 20 cm trudno coś wymyślić innego niż dedykowana komora. To niestety duży wydatek (>1000zł) choć to w zasadzie tylko dość wąski prostokątny słoik-akwarium ze szczelną pokrywą. Majsterklepka może wymyśli jakąś tanią alternatywę (klejone "akwarium"? - tylko kwestia odporności na składniki eluentu? do rozeznania).

Jako że "tanie mięso psi jedzą", dla tego kluczowego elementu zdecydowałem się na markową komorę, w wersji Twin Through (miało umożliwić wygodne kondycjonowanie, w tym samym pojemniku co rozwijanie). W praktyce, dla eluentu C, kondesował się on na ściankach i ściekał do pustej przegrody, co uczyniło wątpliwym użycie dla kondycjonowania. Więc robię je w osobnym pojemniku, tak jak opisałem wyżej. W takim razie jedyną zaletą Twin Through (rozdzielenie wzdłuż podstawy komory na dwa "baseniki eluentu") jest mniejsze zużycie eluentu - wystarczy kilka ml plus kolejne kilka na wysycenie bibuły na ściankach.

Spryskiwacz do kwasu i komora do spryskiwania. 10% roztwór kwasu siarkowego jest dość żrący. Najlepszy jest spryskiwacz szklany (ale to wydatek 300-400zł, przy ściąganiu z Chin ok. 100zł plus czekanie). Ewentualnie można użyć jako tanich spryskiwaczy buteleczkowych z allegro jako jednorazówek (kwas niszczy sprężynkę i plastik). Uwaga! Do pokrycia płytki 20 × 20 cm potrzeba 6-8ml roztworu.
Jako osłona-komora do spryskiwania na dużą płytką sprawdza się dowolny tani duży pojemnik plastikowy. Ustawia się go "na sztorc" i płytkę stawia ± pionowo. Przy małych płytkach komorę do spryskiwania można zrobić z butelki plastikowej z wyciętą z przodu ścianką.

Sensownie można spryskiwać w warunkach domowych, tylko "na dworze". Opary są dość przykre :). Potem spłukać otoczenie dużą ilością wody.

Piecyk lub płyta do wygrzewania. Dla małych płytek wystarczy tania przenośna płyta elektryczna za kilkadziesiąt złotych. Przy większych płytkach trudno uzyskać równomierną temperaturę na całej powierzchni. Z uwagi na ryzyko korozji (pary kwasy siarkowego) można za niewielkie pieniądze kupić na olx jakiś używany piecyk-piekarnik kuchenny elektryczny. Ja używam do wygrzewania starego kuchennego piecyka gazowego, który mogę spisać na straty gdyby skorodował. Konieczne jest skalibrowanie go tak aby uzyskać w miarę stabilną temperaturę 110°C. Nie może być znacznie wyższa (np. 160°C to już źle). W moim wypadku uzyskuję 110°C po 15 minutach na najniższym poziomie gazu i przy nieznacznie uchylonych drzwiczkach. Dla kontroli należy zaopatrzyć się w termometr np. z sondą do pieczenia z wyprowadzeniem pomiaru na zewnątrz, tak aby można kontrolować temperaturę wnętrza piecyka przy zamkniętych lub lekko uchylonych drzwiczkach.

Dedykowane lampy UV do TLC są drogie (>2000 tyś. złotych) lecz z powodzeniem można je zastąpić zdecydowanie tańszą alternatywą. Zwłaszcza, że zabudowa dedykowanych lamp uniemożliwia wykonanie fotografii płytki.

Lampa UV krótkofalowa (UV-C, UV254). Wystarczająca jest tzw. lampa bakteriobójcza (zwykła świetlówka bez luminoforu). Używam takiej w oprawce, długości 23 cm (koszt ok. 100zł). Wystarcza aby równomiernie oświetlić całą płytkę.
Uwaga!!! To długość promieniowania UV jest silnie drażniąca i przy dłuższej ekspozycji trwale uszkadza wzrok. Należy pracować z nią krótko i w nałożonych okularach ochronnych odcinających UV. Sama świetlówka powinna być osłoniętą przed wzrokiem (nie gapić się na nią!) - zwykle wystarczająco osłania odpowiednio trzymana oprawa, ewentualnie z dodaną osłoną-odbłyśnikiem. Jako okulary większość szklanych lub nowoczesnych zwykłych okularów też jest skuteczna - można to sprawdzić umieszczając na drodze pomiędzy świetlówką UV-C a płytką z indykatorem okulary - w "cieniu szybek okularów" świecenie płytki powinno być wygaszone. W praktyce użycie lampy sprowadza się do 2-3 minut na płytkę: kilka razy po kilkanaście sekund przy kontroli ilości analitu i raz po rozwinięciu chromatogramu dla wykonania fotografii w UV254.

Lampa UV długofalowa (UV-A, UV360). Uwaga! tani świetlówkowy tester do banknotów (słabe światło), ani "odstraszająca owady" świetlówka UV-A (duży udział widzialnego) się nie sprawdzą. Idealnie sprawdza się tania lampka diodowa na bateryjkę. Tego typu źródło świata występuje pod różnymi chińskimi inkarnacjami - ja zakupiłem na allegro pod mianem "SuperFire UV03" - jest to latareczka z regulowaną soczewką ogniskującą (ważne aby uzyskać równomiernie oświetlone pole). Wcześniej używałem breloka-gadżetu z "gołą diodką" - też dał radę.
Praktyka pokazała, że dla fotografii (a pożądane i przy obserwacji ocznej) konieczne jest odcięcie filtrem przepuszczającym UV silnej składowej światła widzialnego dość skutecznie maskującej słabą fluorescencję i utrudniającą (a na fotografii uniemożliwiającą) ocenę barwy fluorescencji. Do tego celu można zakupić przez aliexpress stosowny filtr szklany. Wersje koliste ± pasujące do latareczki: "ZWB2 Filter 365nm UG1 U-360 UV Pass Filter Ultraviolet Bandpass Wavelength black optical glass D20.5 × 2mm" lub "ZWB2 Filter 365nm UG1 U-360 UV Pass Filter Ultraviolet Bandpass Wavelength black optical glass D30 × 3mm", sklep "MoWen BohrOptics Store". To koszt kilkudziesięciu złotych i ponad miesiąc oczekiwania na przesyłkę. Można też zakupić tam filtr dla UV254 - ale to raczej zbędny wydatek. I bez niego ciemne plamy substancji absorbujących UV254 są dobrze widoczne na płytkach z indykatorem.

Przy fotografii w UV-A ważne jest umieszczenie pod oświetlaną płytką czarnego papieru - inaczej silne świecenie papieru zagłusza fluorescencję.

Statyw dla wygodnego wykonania fotografii jest wykonany z lekko zmodyfikowanego statywu powiększalnika fotograficznego (w miejsce powiększalnika jest szybkozłączka do lustrzanki).

Dla oświetlenie "normalnym światłem białym" odbitym są użyte dwie lampki biurkowe ze świetlówkami kompaktowymi (daylight) umieszczonymi po przeciwległych bokach.

Dla wykonania zdjęć w świetle przechodzącym użyty jest stary diaskop z oświetleniem "od spodu" (100-200zł na olx). Żarówki do diaskopów 24V/250W są cholernie drogie (300-600zł) i krótkożywotne - 50h. Ponieważ nie ma tu potrzeby dużej jasności, można zużytą wymienić na typową, słabszą i tańszą 24V. (tego jeszcze nie robiłem) Z uwagi na silnie porysowaną soczewkę Fresnela (jest pod szklanym stolikiem diaskopu), dla uzyskania jednorodnego oświetlenie, położono na niej kartkę białego papieru do drukarki.

Dla fotografii mokrej płytki umieszcza się pod płytką czarny papier i oświetla z góry.