Obiektywy mikroskopowe o większym powiększeniu (i aperturze) są projektowane tak, aby uzyskać maksymalną korekcję rozmaitych aberracji optycznych dla jednej, ściśle określonej odległości od obiektywu do obiektu. Czyni się przy projektowaniu optyki obiektywu założenie ściśle określonej grubości szkiełka nakrywkowego i odległości od niego do obserwowanej warstwy w preparacie.
Każde odstępstwo przy normalnym używaniu mikroskopu od optymalnego układu skutkuje pogorszeniem jakości obrazu. W skrajnym wypadku obraz może być niemal nieczytelny (np. pod obiektywem imersyjnym użytym bez imersji).
Skąd się to bierze
a. przestrzeń pomiędzy obiektem a szkiełkiem nakrywkowym, jest ona wypełniona płynem w którym umieszczamy preparat, jest to zwykle woda z barwnikami lub odczynnikami albo sztuczny odpowiednik balsamu kanadyjskiego w preparatach stałych, grubość tej przestrzeni może być najróżniejsza w zależności od preparatu i jego równości, różnią się one współczynnikiem załamania światła, w praktyce należy dążyć do tego aby grubość medium była jak najmniejsza, co w przypadku lepkich (gęstych) mediów jest dość trudne do uzyskania,b. szkiełko nakrywkowe wykonane ze szkła o określonym współczynniku załamania światła, grubość szkiełek nakrywkowych jest różna, to co zwykle można kupić to tzw. sort #1 zawierający szkiełka o grubości 0.13-0.15 mm.
c. przestrzeń pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a szkłem przedniej soczewki obiektywu; ta przestrzeń jest wypełniona w przypadku obiektywów suchych powietrzem, w przypadku imersyjnych odpowiednią cieczą imersyjną, np. dla olejowych olejkiem imersyjnym, wodnych wodą lub płynem fizjologicznym (informacja musi być dostarczona z obiektywem).
Na granicy wszystkich tych ośrodków jeśli różnią się współczynnikami załamania światła (a zawsze się różnią mniej lub bardziej) dochodzi do zjawiska załamania światła ze wszystkimi jego konsekwencjami jak np. rozszczepienie na barwy składowe.
Obliczając korekcje aberracji optycznych w obiektywie konstruktor przyjmuje pod uwagę wpływ elementów występujących pomiędzy obiektywem a obiektem a wpływających na bieg promieni świetlnych. Musi przyjąć założenia. Ponieważ wpływ tych elementów rośnie wraz z aperturą obiektywu (apertura jest wyższa w silniej powiększających obiektywach) założenia przyjęte przy konstruowaniu obiektywu muszą być ściślej przestrzeganej przy silniejszych obiektywach. Jest na nich zwykle wygrawerowane coś w rodzaju: x40, n.a 0.7, 160/0.17 co oznacza, że jest to obiektyw powiększający 40x o aperturze 0.7, dla długości optycznej tubusu mikroskopu 160 mm i z korekcją obliczoną dla grubości szkiełka (*) 0.17 mm.
Dopuszczalne odchylenia od 0.17 mm, tzn. takie które nie powodują silnego pogorszenia jakości obrazu jak nieostrość, słaby kontrast, silna poświata, są coraz mniejsze wraz ze wzrostem apertury obiektywu. Dla obiektywów suchych o aperturze 0.3 wynoszą one +-0.1 mm, dla apertury 0.4 - +-0.045mm, 0.5 - +-0.03, 0.6 - +-0.02, 0.7 - +-0.01 a dla apertury 0.95 tylko +-0.003mm tj. +-3 µm [113].
Dla obiektywów imersyjnych, różnice współczynnika załamania światła pomiędzy poszczególnymi ośrodkami są mniejsze i niekorzystny efekt odchyleń w grubości szkiełek nakrywkowych jest mniejszy lub zgoła pomijalny.
Proszę zauważyć, że z ostatnią sytuacją, tj. z tolerancją na grubość szkiełka rzędu 3µm mamy też do czynienia, gdy używamy obiektywu imersyjnego bez imersji. Apertura takiego obiektywu wynosi wtedy nieco poniżej 1. Dodatkowo jakość obrazu w obiektywach imersyjnych użytych bez imersji jest pogarszana przez fakt, że korekcja aberracji ich układu optycznego została zaprojektowana przy założeniu, że jest imersja pomiędzy przednią soczewką obiektywu a preparatem. ) Użycie obiektywów imersyjnych bez zastosowania imersji nie ma większego sensu, choć nagminnie próbuję tego początkujący lub ignoranci.
Czy trzeba coś z tym robić?
To zależy. Przy obserwacji oczami do pewnego stopnia można ścierpieć mniejszy kontrast i nieostrości, choć jest to bardzo męczące i można przeoczyć subtelne detale. Przy mikrofotografii niestety wszystkie te mankamenty będą widoczne ze zwielokrotnioną siłą - mózg przy obserwacji oczami filtruje wiele niedoskonałości, na fotografii je wszystkie widać.Czy coś można z tym zrobić?
Do pewnego stopnia tak.Regulacja na grubość szkiełka
Lepsze suche obiektywy, o aperturze rzędu 0.95, mają pierścień służący do regulacji korekcji na grubość szkiełka, zwykle w zakresie 0.11-0.23 mm i jest to rozwiązanie najlepsze. Zobacz więcej o obiektywach z regulacją na grubość szkiełka.