Obiektywy mikroskopowe o większym powiększeniu (i aperturze) są projektowane tak, aby uzyskać maksymalną korekcję rozmaitych aberracji optycznych dla jednej, ściśle określonej odległości od obiektywu do obiektu. Czyni się przy projektowaniu optyki obiektywu założenie ściśle określonej grubości szkiełka nakrywkowego i odległości od niego do obserwowanej warstwy w preparacie.
Każde odstępstwo przy normalnym używaniu mikroskopu od optymalnego układu skutkuje pogorszeniem jakości obrazu. W skrajnym wypadku obraz może być niemal nieczytelny (np. pod obiektywem imersyjnym użytym bez imersji).
Skąd się to bierze
a. przestrzeń pomiędzy obiektem a szkiełkiem nakrywkowym, jest ona wypełniona płynem w którym umieszczamy preparat, jest to zwykle woda z barwnikami lub odczynnikami albo sztuczny odpowiednik balsamu kanadyjskiego w preparatach stałych, grubość tej przestrzeni może być najróżniejsza w zależności od preparatu i jego równości, różnią się one współczynnikiem załamania światła, w praktyce należy dążyć do tego aby grubość medium była jak najmniejsza, co w przypadku lepkich (gęstych) mediów jest dość trudne do uzyskania,b. szkiełko nakrywkowe wykonane ze szkła o określonym współczynniku załamania światła, grubość szkiełek nakrywkowych jest różna, to co zwykle można kupić to tzw. sort #1 zawierający szkiełka o grubości 0.13-0.15 mm.
c. przestrzeń pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a szkłem przedniej soczewki obiektywu; ta przestrzeń jest wypełniona w przypadku obiektywów suchych powietrzem, w przypadku imersyjnych odpowiednią cieczą imersyjną, np. dla olejowych olejkiem imersyjnym, wodnych wodą lub płynem fizjologicznym (informacja musi być dostarczona z obiektywem).
Na granicy wszystkich tych ośrodków jeśli różnią się współczynnikami załamania światła (a zawsze się różnią mniej lub bardziej) dochodzi do zjawiska załamania światła ze wszystkimi jego konsekwencjami jak np. rozszczepienie na barwy składowe.
W przypadku obiektywów suchych różnica współczynników załamania światła przy przejściu szkło-powietrze jest szczególnie duża i wymaga szczególnego uwzględnienia w konstrukcji obiektywu.
Obliczając korekcje aberracji optycznych w obiektywie konstruktor przyjmuje pod uwagę wpływ elementów występujących pomiędzy obiektywem a obiektem a wpływających na bieg promieni świetlnych. Musi przyjąć założenia. Ponieważ wpływ tych elementów rośnie wraz z aperturą obiektywu (apertura jest wyższa w silniej powiększających obiektywach) założenia przyjęte przy konstruowaniu obiektywu muszą być ściślej przestrzeganej przy silniejszych obiektywach. Jest na nich zwykle wygrawerowane coś w rodzaju: x40, n.a 0.7, 160/0.17 co oznacza, że jest to obiektyw powiększający 40x o aperturze 0.7, dla długości optycznej tubusu mikroskopu 160 mm i z korekcją obliczoną dla grubości szkiełka (*) 0.17 mm.
(*) 0.17 mm grubość szkiełka tak naprawdę oznacza, że dla optymalnej obserwacji suma: grubości szkiełka i medium pomiędzy górną powierzchnią preparatu i dolną stroną szkiełka nakrywkowego, powinna mieć 170 µm. (precyzyjnie - gdy medium ma współczynnik załamania światła jak szkiełko)
Dopuszczalne odchylenia od 0.17 mm, tzn. takie które nie powodują silnego pogorszenia jakości obrazu jak nieostrość, słaby kontrast, silna poświata, są coraz mniejsze wraz ze wzrostem apertury obiektywu. Dla obiektywów suchych o aperturze 0.3 wynoszą one +-0.1 mm, dla apertury 0.4 - +-0.045mm, 0.5 - +-0.03, 0.6 - +-0.02, 0.7 - +-0.01 a dla apertury 0.95 tylko +-0.003mm tj. +-3 µm [113s8].
Dla obiektywów imersyjnych, różnice współczynnika załamania światła pomiędzy poszczególnymi ośrodkami są mniejsze i niekorzystny efekt odchyleń w grubości szkiełek nakrywkowych jest mniejszy lub zgoła pomijalny.
Gdy nie dysponujemy takim obiektywem mamy w praktyce jedynie upewnienie się, że zrobiliśmy wszystko, aby odległość od górnej powierzchni szkiełka do obserwowanej warstwy preparatu była możliwie bliska optimum (tj. 0.17mm).
Za cienkie szkiełko
Na grubość szkiełka mamy niewielki wpływ - choć warto się upewnić o jakiej grubości szkiełka stosujemy. Jak pisałem wcześniej te co jest standardowo sprzedawane to tzw. sort 1 lub bez podanej adnotacji, ma zwykle grubość poniżej 0.14mm. Przy obserwacji np. zarodników grzybów w pojedynczej warstwie raczej nie występuje sytuacja aby nad ich górną powierzchnią było jeszcze 30 µm medium. Zwykle szkiełko nakrywkowe opiera się na nich, a ostrość mamy ustawioną kilka µm poniżej jego powierzchni. Grubość całego układu szkiełko-medium to góra 0.15 mm. Rozwiązaniem może być grubsze szkiełko. Tzw. sort #1 1/2 to szkiełka o grubości 0.16-0.18 mm. Te byłyby chyba lepsze w tym układzie. Niestety w normalnym zaopatrzeniu się nie znajdują, zresztą, gdy się pytać sprzedawcy też nie wiedzą o co chodzi, to egzotyczne wymaganie. Widziałem takie w ofercie firm zagranicznych.O samodzielnym wysortowaniu szkiełek nie ma co marzyć. Raz że to żmudna robota, dwa że szkiełka już są sprzedawane wysortowane, w mniejszym niż 0.17mm przedziale rozmiarów. Zmierzone przeze mnie 10 indywidualnych szkiełek oscylowały blisko 0.14 mm z tendencją raczej w dół tej wartości. Zobacz opis opis techniki pomiar grubości (szkiełek), także pod mikroskopem.