Odczynniki

Odczynniki stosuje się dla wywołania dodatkowych cech co ułatwia lub czasami wręcz umożliwia określenie gatunku grzybów.

space

Odczynniki w mikroskopii stosuje się analogicznie - tj. dla charakterystycznego wybarwiania komórek lub ich elementów oraz dodatkowo dla stworzenia optymalnego kontrastu przy obserwacji mikroskopowej. Często dzięki barwnikom uwidacznia się normalnie niewidoczne struktury mikroskopowe.

Niezbędnik


Skompletowanie wszystkich odczynników może być dość trudne. Są jednak te absolutnie niezbędne (bo często stosowane i dających odróżniające reakcje dla licznych gatunków grzybów o dużych owocnikach) i stosunkowo łatwe do pozyskania.

Postaraj się mieć zawsze pod ręką do wywoływania reakcji makrochemicznych:
1. KOH lub NaOH w roztworze wodnym w stężeniu 40%,
2. Wodny roztwór siarczanu żelaza (II), FeSO4.
Świetnie, gdy będziesz jeszcze miał amoniak i formalinę.

space

Szczegółowy opis przygotowania odczynników, reakcji i ich stosowania znajduje się poniżej.

Odczynniki do reakcji makrochemicznych

KOH lub NaOH, wodorotlenek potasu lub wodorotlenek sodu
Oba wodorotlenki powinny dawać identyczną reakcję i mogą być zamiennie stosowane. Jeśli jest możliwość należy jednak preferować KOH jako częściej cytowane w literaturze. Stosuje się stężony roztwór wodny, w granicach 30-50%. Singer zaleca stosowanie mniej stężonego 25% dla rodzaju zasłonak (Cortinarius). Wodorotlenki te są sprzedawane w postaci białych, stałych, płatków. Przygotowanie polega na rozpuszczeniu wodorotlenku w wodzie destylowanej. Rozpuszczać należy wsypując płatki małymi partiami i mieszając - Uwaga! substancja żrąca, koniecznie nałożyć okulary dla ochrony oczu. Należy uważać ponieważ podczas rozpuszczania szybko rośnie temperatura roztworu. Roztwór wodny można przechowywać nieograniczenie długo, światło nie szkodzi. Lepsze są pojemniki plastikowe z polietylenu, ponieważ odczynnik rozpuszcza szkło (butelki nie przeżre na wylot, ale w ten sposób odczynnik jest zanieczyszczany. W razie kontaktu ze skórą należy możliwie szybko spłukać dużą ilością wody.

Badanie wykonuje się kładąc kroplę odczynnika na badaną część grzyba. Zwykle jest to powierzchnia trzonu, powierzchnia kapelusza lub miąższ w różnych częściach owocnika. Zwykle nie występuje zmiana zabarwienia lub jedynie słabe brunatnienie lub żółknięcie. W przypadku niektórych gatunków ten odczynnik powoduje intensywną reakcję barwną np. muchomor jadowity (Amanita virosa) na wszystkich częściach owocnika przybiera w kilka sekund intensywnie cytrynowożółtą do chromowżółtej barwę. W ten sposób można odróżnić zewnętrznie niemal identycznego mleczaj piekący (Lactarius bertillonii) od mleczaj chrząstka (Lactarius vellereus), sok mleczny tego pierwszego pod działaniem odczynnika natychmiast przyjmuje pomarańczową barwę. Wśród zasłonak (Cortinarius) odczynnik stosowany na skórkę kapelusza, różne miejsce trzonu i miąższ w przypadku niektórych gatunków daje silną barwną reakcję. Podobnie w przypadku niektórych wodnicha (Hygrophorus).

W niższym stężeniu (2-5%) roztwory tych wodorotlenków są wykrzystywane przy mikroskopowaniu, dla rozmiękczenia i ułatwienia rozdzielenia komórek materiału.

Xerocomus spadiceus (podgrzybek żeberkowany)

NH40H, wodorotlenek amonu
Stosuje się wodny stężony roztwór amoniaku dostępny w handlu jako woda amoniakalna (zawiera on 30-40% amoniaku). Umieszcza się krople roztworu na badanym elemencie (zwykle powierzchnia kapelusza lub trzonu). Często wystarczy zbliżyć aplikator i reakcja barwna następuje pod wpływem par amoniaku.
Ten odczynnik wyróżnia podgrzybek żeberkowany (Xerocomus spadiceus) spośród innych podgrzybków barwną zielononiebieską reakcją skórki kapelusza na swoje opary.
FeS04, siarczan żelaza (II)
Siarczan żelaza (II) jest kupowany w postaci zielonych kryształków. Stosuje się bezpośrednio kryształki, kładzione na cięciu i wgniatane w miąższ lub 10% roztwór wodny. Singer zaleca dodanie 1 kropli stężonego kwasu siarkowego na 10 cm3 roztworu. Siarczan żelaza w roztworze stosunkowo szybko (dni, tygodnie) utlenia się do rdzawych tlenków żelaza, co maskuje i utrudnia ocenę ewentualnych reakcji barwnych. Dlatego należy go przygotowywać możliwie na świeżo. Radzi się też dodać kroplę kwasu siarkowego, ma wtedy być trwalszy.

space

Kwas siarkowy jest używany dla barwnych reakcji makrochemicznych w rodzaju koralówka (Ramaria).

anilina
Anilina w postaci roztworu wodnego jest używana dla wywołania barwnej reakcji Schaeffera u pieczarka (Agaricus).

space

Zobacz uwagi przy alfa-naftolu który można stosować jako zamiennik gwajaku i jest łatwiejszy w użyciu (choć nie daje tak pięknych barw jak gwajak).

alfa-naftol
Roztwór alkoholowy alfa-naftolu. 0.5 g alfa-naftolu w 10 cm3 spirytusu rektyfikowanego. Reakcja analogiczna barwna analogiczna do gwajaku tyle, że o wiele wolniejsza (ca. 5-20× wolniejsza) i zajmuje sekundy do kilku minut. Stosowałem na wielu gołąbkach, na tych samych egzemplarzach, gwajak i alfa-naftol i za każdym razem natychmiastowej i intensywnej reakcji z gwajakiem odpowiedała szybka i intensywna reakcja z naftolem. Brakowi reakcji z gwajakiem odpowiadał jej brak z naftolem.

Ponieważ naftol może być łatwiejszy do pozyskania niż żywica gwajaku można go stosować jako zamiennik. Naftol jest też łatwiejszy w przygotowaniu roztworu (rozpuszcza się w alkoholu łatwo i niemal natychmiast) i chyba roztwór jest trwalszy.

fenol
Stosuje się 2-3% roztwór wodny, tzw. wodę karbolową. Uwaga wrażliwy na światło i żrący.
azotan srebra, AgNO3
Stosuje się 10% roztwór wodny. Odczynnik jest wrażliwy na światło. Stosowany u zasłonak (Cortinarius), u niektórych czernieje.

Oczynniki stosowane w mikroskopii

Nawilżanie suchego materiału

Suchy materiał (eksykaty) jeśli jest bardzo kruchy wymaga nawilżenia aby można było wykonać cięcie lub rozdzielić fragmenty bez obawy pokruszenia całego okazu. Można "uelastycznić" eksykat przez zamknięcie go na jakiś czas w małym plastikowym pojemniku do którego wkładamy kawałek nawilżonego papieru - tak jednak aby nie dotykał nawilżanego materiału. Po odcięciu milimetrowego fragmentu do obserwacji (dla preparatów gniecionych, np. u workowców 1 mm2 jest często wystarczający) umieszczamy go w wodzie lub w roztworze zasady (5-10% KOH lub amoniak), która ułatwia zmiękczenie materiału, powoduje pęcznienie i rozluźnienie strzępek.

Wg. Breitenbacha /Breitenbach J., Kraenzlin F., 1986 [26II]/ woda niekoniecznie jest najlepszym zwilżaczem ponieważ dezorganizuje materiał. Poleca on bardziej wyrafinowany sposób wg receptury Clemencon:
Do zwilżania służy roztwór: 80ml 96% etanolu (spirytus rektyfikowany), 20ml stężonego amoniaku, 1ml gliceryny.
Materiał jest zwilżany kilkoma kroplami tego roztworu, po kilku minut jest nawilżony, jeśli jest zbyt wilgotny, pozwala mu się nieco podeschnąć, aby nabrał woskowej konsystencji, wtedy można wykonać potrzebne przekroje do preparatu.
Sam preparat umieszcza się w amoniaku lub innych, opisanych poniżej odczynnikach aby się rozprostował i rozluźnił.

space

Barwienie preparatów

W razie konieczności zastosowania kilku barwników (a tak jest zazwyczaj) obserwacje wykonuje się w kolejności: w wodzie destylowanej (dla obserwacji utworów rozpuszczających się w kwasach lub zasadach), w odczynniku Melzera (dla określenia amyloidalności, bądź dekstrynoidalności), w roztworze KOH lub NH4OH (dla obserwacji np. chrysocystyd), amoniakalnym roztworze czerwieni Kongo i wreszcie w kwaśnym błękicie anilinowym lub laktofenolu. /Breitenbach J., Kraenzlin F., 1986 [26II]/

space

Dla ułatwienia zwilżenia materiału można stosować dodatek detergentu. Częstym problemem jest wysychanie medium w czasie obserwacji mikroskopowej - pomocne jest dodanie ok. 10% gliceryny.

wodny roztwór KOH
Stosuje się w stężeniu 2-5% lub do 10%. Często stosowane medium przy obserwacji mikroskopowej, zwłaszcza suchego materiału, ponieważ rozluźnia tkankę i ułatwia separację interesujących komórek. Powoduje pęcznienie komórek a nieprzejrzyste elementy rozjaśniają się. W praktyce NH4 możę być wygodniejszym rozwiązaniem ponieważ nie tworzy kryształków przy wysychaniu medium pod szkiełkiem nakrywkowym.

KOH może wywoływać barwne reakcje, podobnie jak amoniak. Zawartość niektórych cystyd wybarwia się na żółto (są to wtedy tzw. chrysocystydy).

space

Odczynnik Melzera - 0.5g jodu, 1.5g jodku potasu w 20 cm3 wody. Przed badaniem dodaje się równą ilościowo ilość wodzianu chloralu. Odczynnik ma trwałość do kilku miesięcy. Kłopot może wynikać z uwagi na to, że wodzian chloralu jest substancją trującą nie znajdującą się w normalnym obrocie handlowym. Na szczęście możemy z powodzeniem zastąpić ten odczynnik dostępnym w aptece:
płynem Lugola - roztwór 1 częsci jodu i 2 części jodku potasu w 150 (do 300) częściach wody.
Praktycznie różnicy w wybarwieniu nie ma (w Melzerze teoretycznie tkanki powinny być przejrzystsze). Przy pomiarach dla celów naukowych warto jednak pozyskać Melzera z racji na to, że może występować różnica w stopniu pęcznienia tkanek pomiędzy oboma odczynnikami.

space

Russula caerulea (gołąbek błękitny)
zarodniki Russula caerulea w wodzie
Russula caerulea (gołąbek błękitny)
zarodniki tego samego gatunku w odcz. Melzera

czerwień Kongo, Kongo Red
Barwnik generalnie wybarwiający ściany komórkowe grzybni, niektóre wybarwia silniej (często cystydy) dając pożądany kontrast przy obserwacji mikroskopowej. Stosunkowo łatwo i szybko penetruje i wybarwia tkanki także, gdy jest wpuszczany pod szkiełko nakrywkowe.

space

Wodny roztwór barwnika jest krótkotrwały. Przygotowuje się go jako nasycony roztwór. W praktyce wystarcza szczypta na 10ml wody destylowanej. Po dobie filtrować. Trwałość wg mojego doświadczenia przynajmniej kilka miesięcy.

Wg. Clemencon można też sporządzić stosunkowo trwały roztwór alkoholowy: 0.2-0.5g błękitu krezolowego, rozpuszczony w mieszaninie: 17ml glicerolu, 27mm 97% alkoholu etylowego (spirytus rektyfikowany) i 55mm wody destylowanej, 0.5ml Invadin IFC (co to jest?). Po tygodniu przefiltrować.

błękit metylenowy
Barwnik do ogólnego barwienia, zwłaszcza strukt bezbarwnych i słabo kontrastowych.

space

Roztwór w proporcji 1:1 przygotwany z kryształków waniliny i 70% kwasu siarkowego (3 ml wody, 8 ml stężonego kwasu siarkowego).

space

Analogiczne efekty uzyskamy zastępując wanilinę formaliną (sulfoformol).

gliceryna, glicerol
Jako składnik niektórych mediów przy mikroskopowaniu. Spowalnia wysychanie medium co umożliwia dłuższą obserwację.
roztwory nasycone, plazmoliza, pigmentacja
Pigment zabarwiający tkanki grzyba może być umieszczony w cytoplaźmie lub w ścianach komórkowych i przestszeniach międzykomórkowych. Dla obserwacji (na świeżym materiale) stosuje się obserwację w nasyconym wodnym roztworze cukru (sacharozy) lub chlorku sodu (sól kuchenna). Następuje wtedy odwodnienie cytoplazmy, która odstaje wtedy od ścian komórkowych i łatwo stwierdzić gdzie umieszczony jest barwnik.

Charakterystyczne mikroskopowe reakcje barwne

amyloidalny
Zmieniający barwę w odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor szaroniebieski do ciemnoniebieskiego, aż czarnego np. urzeźbienie zarodników gołąbek (Russula) (umożliwiając obserwację tego urzeźbienia - inaczej niewidocznego), pozwala też różnicować gatunki w obrębie rodzaju na posiadające amyloidalne zarodniki i z nieamyloidalnymi zarodnikami (np. u muchomor (Amanita)). Możemy też pamiętać ze szkoły średniej tą barwną reakcję obserwowaną na ziarnach skrobi ziemniaczanej. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz też dekstrynoidalny.
cjanofilny
Silnie wybarwiający się w błękicie anilinowym. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni wybarwiają się intensywniej niż inne tkanki - nazywamy je cjanofilnymi.
dekstrynoidalny
Zmieniający barwę w odczynniku Melzera lub innego roztworu jodu. Zarodniki lub ich struktury powierzchniowe oraz komórki grzybni u niektórych gatunków wybarwiają się w tym odczynniku na kolor brązowy, czerwonawy do winno-czerwonego. Zmiana zabarwienia utrzymuje się po usunięciu odczynnika, po przepłukaniu wodą destylowaną.
Zobacz też amyloidalny.
metachromatyczny
Elementy tkanek i komórek odmiennie, czerwono-fioletowo, wybarwione przy barwieniu błękitem krezolowym.
reakcja Schaeffera
Stosuje się u pieczarka (Agaricus). Rysuje się na powierzchni kapelusza kreskę wodą anilinową i na krzyż drugą kreskę stężonym kwasem azotowym. W przypadku pozytywnej reakcji miejsce przecięcia przybiera płomieniście pomarańczową barwę. Reakcja negatywna to brak zmiany zabarwienia powierzchni kapelusza.
literatura · references
· Horak, E. 2005., — Röhrlinge und Blätterpilze in Europa. [102]
· Baral, H.O., 2001 August, — Glossar on Vital Taxonomy. [103]
· Moser, M., 1983 — Die Roehrlinge und Blaetterpilze (Polyporales, Boletales, Agaricales, Russulales) in Kleine Kryptogamenflora, Band IIb/2. [27]
· Breitenbach J., Kraenzlin F., 1986 — Fungi of Switzerland 2 - Non gilled fungi [26II]
· Skirgiełło A., 1960 — Flora Polska. Grzyby (Mycota). Tom I. Borowikowate (Boletales). p.20 [16]
obecnie nie jesteś zalogowany(a) — oglądasz okrojoną, przeglądową wersję atlasu — zaloguj się (pola w prawym górnym rogu każdej strony)
lub załóż konto dostępu o ile go jeszcze nie posiadasz

Copyright © 1997-2017 by Marek Snowarski – formularz kontaktowy/contact form
przeglądowa (zwykła) wersja atlasu 17.06.17 · ta strona była ostatnio zmieniana/last modified 15.04.2017 · powstała/was created 27.02.2004

Zalinkuj tę stronę kodem (przykładowy tekst linku dostosuj do swoich potrzeb):
<a href="http://www.grzyby.pl.pl/slownik-odczynniki.htm"> Odczynniki - Atlas grzybów Polski grzyby.pl</a>